Clostridium difficile 503/16, «Альфа-06»

• Бактерии
• Московский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского, Москва
• 2018 г.

Цель испытаний: изучение активности импульсного ультрафиолетового излучения сплошного спектра, генерируемого импульсной установки «Альфа-06», в отношении спор клинического штамма C.difficile.

Задача НИР: Определение эффективности обеззараживания открытых поверхностей, контаминированных спорами Clostridium difficile, импульсным ультрафиолетовым излучением сплошного спектра, генерируемым импульсной установкой «Альфа-06».

Работы выполнены в соответствии с договором № 114 от 18.06.2018 г.

Место и время проведения испытаний: ФБУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора, сентябрь-декабрь 2018 года.

Материалы и методы

Оборудование:

• Опытный образец Установки импульсной ультрафиолетовой передвижной для обеззараживания воздуха и поверхностей помещений «Альфа-06» (далее – установка «Альфа-06)

• Анаэробная рабочая станция Bactron (Sheldon Manufacturing Inc., США)

Тест-поверхности: стерильные пластиковые чашки Петри одноразового использования.

Питательные среды:

• «Anaerobic Agar» («Becton Dickinson», США) с 7% (об/об) цельной бараньей крови

• «Clostridium difficile Agar Base» («HiMedia Labs», Индия)

Характеристика объекта исследования: клинический штамм Clostridium difficile 503/16 изолирован от пациента с клинической картиной Clostridium difficile – ассоциированной инфекции. Споры овалбьные субтерминальные. Вегетативная форма ферментирует глюкозу, маннит, салицин, маннозу и мелецитозу, лактозы, сахарозы, мальтозы, не ферментирует ксилозу, арабинозу, глицерол, целлобиозу, раффинозу, сорбит, рамнозу, трегалозу; не продукцирует индол и уреазу, гидролизует желатин и эскулина. Штамм резистентный к метронидазолу, цефепиму, клиндамицину. Чувствителен к ванкомицину.

Идентификация и оценка чувствительности (резистентности) клинического штамма Clostridium difficile 503/16 к антибиотикам выполнена в Государственном Научном Центре Колопроктологии (Зав. лабораторией к.м.н. Сухина М. А.) с использованием тест-систем «API 20A», «ATB ANA» («bioMerieux», Франция). Также для идентификации использовали определение белковых спектров с помощью MALDI-TOF масс-спектрометрии.   Исследование чувствительности клинического штамма проводилось в соответствии с рекомендациями NCCLS/CLSI с определением МПК методом разведений в агаре (Бруцелла агар, Becton Dickinson, США) с добавлением гемина (5 мкг/мл), витамина K1 (1 мкг/мл) (Becton Dickinson, США) и лизированной бараньей крови (итоговая концентрация — 5 %).

Исследования эффективности импульсного ультрафиолетового излучения сплошного спектра, генерируемого установкой «Альфа-09», проводили в соответствии с представленной ниже схемой эксперимента:

1. подготавливали вертикальную поверхность для крепления на них чашек Петри;

2. чашки Петри крепили на одной высоте с лампой установки «Альфа-06»;

3. установку располагали на расстоянии 2 м к подготовленной вертикальной поверхности;

4. включали установку в сеть;

5. в соответствии с руководством по эксплуатации нажимали кнопку включения и устанавливали требуемое время;

6. включали установку в режим генерации вспышек.

Методология исследования:

• получение биомассы C. difficile: культуру C. difficile засевали по 100мкл 1 McF на чашки Петри, использовали Селективный агар для Clostridium difficile (Oxoid), посевы инкубировали в анаэробной атмосфере (азот — 80%, водород — 5%, углекислый газ — 10%) при температуре 37⁰С в течение 48 часов, затем ещё 48-72 часа при 22⁰С;

• на 4-е и 6-е сутки инкубации при 22⁰С в анаэробной атмосфере культуру тестировали на интенсивность спорообразования. Она составила 96% в поле зрения от общего числа клеток (достаточное количество - не менее 90% спор в поле зрения от общего числа клеток);

• после завершения спорообразования культуру осторожно смыли с поверхности плотной питательной среды во флаконы со стерильным изотоническим раствором хлорида натрия,

• подвергли споровую культуру тепловому шоку, прогревая при температуре 900С в течение 30 минут,

• приготовили бактериальную взвесь плотностью 1 McF,

• провели контроль количества споровых клеток в 1 McF при исследовании 10 полей зрения мазков, окрашенных по Ауэски (%) - получили 95% споровых клеток в поле зрения от общего количества клеток.

• нанесли 100 мкл микробной взвеси на поверхность стерильной пластиковой чашки Петри, распределили по поверхности и подсушили.

• чашки крепили вертикально к стене на двойной скотч по линии воздействия УФИ на расстоянии 2 или 4 метра.

• опытные чашки подвергали воздействию лампы на воздухе, контрольные чашки в течение того же времени не подвергались воздействию лампы, но находились в аэробных условиях.

Перед началом облучения с чашек Петри, контаминированных споровой культурой, снимали крышки. После завершения времени воздействия УФ излучением чашки немедленно помещались в анаэробную атмосферу, с их поверхности стерильными смывали изотоническим раствором содержимое в 1000 мкл. Далее титровали полученную взвесь до разведения -1, -2, -3 и засевали по 100мкл из каждого разведения на питательную среду в чашки Петри диаметром 90мм. Посевы инкубировали в условиях бескислородной среды при температуре 37⁰С 24-48 часов. После инкубации подсчитывали количество колоний, выросших на каждой чашке Петри, и с помощью специальных формул рассчитывали количество клеток (спор) в 1мл плотностью 1 McF.

Исследования проводили в трёх повторностях для каждого временного режима, удаленности от облучателя и вида микроорганизмов (всего 24 точки).

Эффективность установки «Альфа-06» в отношении спор C. difficile (%) вычисляли по формуле: (среднее количество спор на контрольных чашках — среднее количество спор на опытных чашках): среднее количество спор на контрольных чашках х 100.

Для средств химической дезинфекции при обработке поверхностей помещений и объектов больничной среды принят критерий эффективности режимов применения 99,99% (4lg). Для изучаемого метода критерии эффективности профилактической дезинфекции поверхностей не разработаны, но они не могут быть меньше указанного уровня.

Результаты изучения эффективности импульсного ультрафиолетового излучения, генерируемого установкой «Альфа-06», в отношении споровой формы клинического штамма C.difficile, нанесенной на вертикально ориентированные пластиковые тест-поверхности, расположенные на расстоянии 2-х метров от облучателя при разном времени воздействия, представлены в таблице 1.

Табл.1. Эффективность установки «Альфа-06» в отношении споровой формы клинического штамма C.difficile при разном времени воздействия на расстоянии 2 метра от источника облучения.

Результаты выполненных исследований показали, что импульсное ультрафиолетовое излучение сплошного спектра, генерируемое установкой «Альфа-06», обладает выраженным спороцидным действием.

На расстоянии 2-х метров от установки «Альфа-06» споровые формы клинического штамма C.difficile были уничтожены импульсным ультрафиолетовым излучением сплошного спектра на 99,996% за 4 минуты воздействия. Данный режим не имеет аналогов среди зарегистрированных средств химической дезинфекции. Наиболее близкий режим имеют спороцидные средства на основе диоксида хлора. За 16 минут облучения тест-объектов, контаминированных споровыми формами клинического штамма C.difficile, достигнута 100% эффективность.

1. Показана высокая эффективность импульсной ультрафиолетовой установки «Альфа-06», генерирующей ультрафиолетовое излучение сплошного спектра, при обеззараживании вертикально ориентированных тест-поверхностей, контаминированных споровой формой клинического штамма C.difficile, который обладает высоким эпидемическим потенциалом.

2. Установлено, что эффективность обеззараживания поверхностей, контаминированных споровыми формами клинического штамма C.difficile и расположенных на расстоянии 2 метра от источника излучения, достигается за 4 минуты работы установки «Альфа-06».

3. Полученные в исследованиях уровни эффективности импульсных ультрафиолетовых установок соответствуют критериям эффективности, принятым для дезинфицирующих средств, применяемых в режиме дезинфекции поверхностей помещений и объектов больничной среды (99,99%) (Руководство Р 4.2.2643-10 «Методы лабораторных исследований и испытаний дезинфекционных средств для оценки их эффективности и безопасности», М. 2011 г.)

Практические рекомендации для медицинских организаций

1. Рекомендуется применять импульсную ультрафиолетовую установку «Альфа-06» при проведении комплекса дезинфекционных мероприятий для обеззараживания поверхностей от споровых форм клинических штаммов C.difficile в структурных подразделениях медицинских организаций с высокими рисками возникновения и распространения клостридиальных инфекций. Основание - высокая эффективность (более 99,99% за 4 минуты воздействия на расстоянии 2 метра от источника излучения).