Clostridium difficile 503/16, УИКб-01-«Альфа»

• Бактерии
• Московский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского, Москва
• 2016 г.

Научный отчет
по результатам изучения эффективности импульсного УФ излучения сплошного спектра, генерируемого установкой УИКб-01—«Альфа», в отношении спор резистентного к антимикробным препаратам клинического штамма C.difficile.

Цель испытаний: изучение активности импульсного ультрафиолетового излучения сплошного спектра, генерируемого импульсной установкой УИКб-01-«Альфа», в отношении спор резистентного к антимикробным препаратам клинического штамма C.difficile.

Задачи НИР:

1. Исследование активности импульсного УФ излучения сплошного спектра в отношении спор клинического штамма C.Difficile.

2. Определение режимов работы установки УИКб – 01-«Альфа» для обеззараживания помещений, потенциально контаминированных спорами клинических штаммов Clostridium difficile.

3. Разработка практических (клинических) рекомендаций по обеззараживанию поверхностей, контаминированных спорами Clostridium difficile, в медицинских организациях.

Работы выполнены в соответствии с договором № 62 от 10.02.2015 г.

Место и время проведения испытаний: ФБУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора, март-апрель 2016 года.

Материалы и методы

Оборудование:

• Установка импульсная ксеноновая УФ-бактерицидная для экстренной дезинфекции воздуха помещений 1 и 2 категории при отсутствии людей УИКб-01-«Альфа» производство ООО «НПП «Мелитта», Россия (Регистрационное удостоверение № ФСР 2010/06906 от 26.02.2010 г.; Сертификат соответствия ГОСТ Р № РОСС RU.ИМ04.В07590 по 08.03. 2013 г.); Облучение проводится при разном времени воздействия (2 мин, 4 мин, 8 мин, 16 минут) и расстоянии от источника излучения (2 и 4 метра).

• Анаэробная рабочая станция Bactron (Sheldon Manufacturing Inc., США)

Тест-поверхности: стерильные пластиковые чашки Петри одноразового использования.

Питательные среды:

• «Anaerobic Agar» («Becton Dickinson», США) с 7% (об/об) цельной бараньей крови

• «Clostridium difficile Agar Base» («HiMedia Labs», Индия)

Характеристика объекта исследования: клинический штамм Clostridium difficile 503/16 изолированный от пациента с клинической картиной Clostridium difficile – ассоциированной инфекции.

Идентификация и оценка чувствительности (резистентности) к антибиотикам выполнялись с использованием тест-систем «API 20A», «ATB ANA» («bioMerieux», Франция). Также для идентификации использовали определение белковых спектров с помощью MALDI-TOF масс-спектрометрии.   Исследование чувствительности анаэробных бактерий проводилось в соответствии с рекомендациями NCCLS/CLSI с определением МПК методом разведений в агаре (Бруцелла агар, Becton Dickinson, США) с добавлением гемина (5 мкг/мл), витамина K1 (1 мкг/мл) (Becton Dickinson, США) и лизированной бараньей крови (итоговая концентрация — 5 %). Споры овальные субтерминальные, Ферментируют глюкозу, маннит, салицин,    маннозу и мелецитозу, лактозы, сахарозы, мальтозы, не ферментируют ксилозу, арабинозу, глицерол, целлобиозу, раффинозу, сорбит, рамнозу, трегалозу; не продуцируют индол и уреазу, гидролизуют желатин и эскулин. Штамм резистентный к метронидазолу, цефепиму, клиндамицину. Чувствителен к ванкомицину.

Методология исследования:

1. получение биомассы C. difficile: культуру C. difficile засевали по 100мкл 1 McF на чашки Петри, использовали селективную питательную среду «Clostridium difficile Agar Base» («HiMedia Labs», Индия), посевы инкубировали в анаэробной атмосфере (азот — 80%, водород — 5%, углекислый газ — 10%) при температуре 37⁰С в течение 48 часов, затем ещё 48-72 часа при 22⁰С;

2. на 4-е и 6-е сутки инкубации при 22⁰С в анаэробной атмосфере культуру тестировали на интенсивность спорообразования. Она составила 96% в поле зрения от общего числа клеток (достаточное количество - не менее 90% спор в поле зрения от общего числа клеток);

3. после завершения спорообразования культуру осторожно смыли с поверхности плотной питательной среды во флаконы со стерильным изотоническим раствором хлорида натрия,

4. подвергли споровую культуру тепловому шоку, прогревая при температуре 75⁰С в течение 10 минут,

5. приготовили бактериальную взвесь плотностью 1 McF,

6. провели контроль количества споровых клеток в 1 McF при исследовании 10 полей зрения мазков, окрашенных по Ауэски (%) - получили 95% споровых клеток в поле зрения от общего количества клеток.

7. нанесли 100 мкл микробной взвеси поверхности стерильной пластиковой чашки Петри, распределили по поверхности и подсушили. Чашки крепили вертикально к стене на двойной скотч по линии воздействия УФИ на расстоянии 2 или 4 метра.

8. опытные чашки подвергали воздействию лампы на воздухе, контрольные чашки в течение того же времени не подвергались воздействию лампы, но находились в аэробных условиях.

Перед началом облучения с чашек Петри, контаминированных споровой культурой, снимали крышки. После завершения времени воздействия УФ излучением чашки немедленно помещались в анаэробную атмосферу, с их поверхности стерильными смывали изотоническим раствором содержимое в 1000 мкл. Далее титровали полученную взвесь до разведения -1, -2, -3 и засевали по 100мкл из каждого разведения на питательную среду в чашки Петри диаметром 90мм. Посевы инкубировали в условиях бескислородной среды при температуре 37⁰С 24 часа. После инкубации подсчитывали количество колоний, выросших на каждой чашке Петри, и с помощью специальных формул рассчитывали количество клеток (спор) в 1мл плотностью 1 McF.

Эффективность УИКб-01-«Альфа» в отношении спор C. difficile (%) вычисляли по формуле: (среднее количество спор на контрольных чашках — среднее количество спор на опытных чашках): среднее количество спор на контрольных чашках х 100.

Исследования проводили в трёх повторностях для каждого времени воздействия и расстояния от источника излучения. Для n=3 вычисляли среднее количество спор на контрольных чашках и число выживших спор на опытных чашках.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Результаты изучения эффективности импульсного ультрафиолетового излучения, генерируемого установками УИКб-01-«Альфа»,   в отношении споровой формы клинического штамма C.difficile, нанесенной на вертикально ориентированные пластиковые тест-поверхности, расположенные на расстоянии 2-х и 4-х метров от облучателя при разном времени воздействия, представлены в таблице 1.

Табл.1. Эффективность обеззараживания импульсным УФ излучением установки УИКб-01-«Альфа» тест-поверхностей контаминированных споровыми формами клинического штамма C.difficile при разном времени воздействия на расстоянии 2 и 4 метра от источника облучения.

Примечание: 3,8 x 10*8 КОЕ/мл, 1McF

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Результаты выполненных исследований показали, что импульсное ультрафиолетовое излучение сплошного спектра, генерируемое установкой УИКб-01-«Альфа», обладает выраженным спороцидным действием. На расстоянии 2-х метров от источника излучения 100% эффективность в отношении споровых форм клинического штамма C.difficile достигается после 8 минут воздействия, что соответствует не менее 4 lg. При увеличении расстояния от источника излучения до контаминированных поверхностей от 2-х до 4-х метров время, необходимое для достижения 100% эффективности также увеличивается в 2 раза и составляет 16 минут.

ВЫВОДЫ:

1. Установлена высокая эффективность импульсных ультрафиолетовых установок УИКб-01-«Альфа» при обеззараживании вертикально ориентированных тест-поверхностей, контаминированных споровой формой клинического штамма C.difficile, который обладает высоким эпидемическим потенциалом.

2. Определен режим работы импульсных ультрафиолетовых установок УИКб-01-«Альфа», обеспечивающих обеззараживание контаминированных спорами клинических штаммов C.difficile поверхностей с эффективностью более 99,99% (> 4lg) и расположенных от 2 до 4 метров. Время облучения составляет 8 и 16 минут соответственно.

3. Полученные в исследованиях уровни эффективности импульсных ультрафиолетовых установок соответствуют критериям эффективности, принятым для дезинфицирующих средств, применяемых в режиме дезинфекции поверхностей помещений и объектов больничной среды (99,99%) (Руководство Р 4.2.2643-10 «Методы лабораторных исследований и испытаний дезинфекционных средств для оценки их эффективности и безопасности», М. 2011 г.)

Практические рекомендации для медицинских организаций.

1. Включать импульсные ультрафиолетовые установки УИКб-01-«Альфа» в комплекс дезинфекционных мероприятий (профилактическая и очаговая дезинфекция поверхностей)  в структурных подразделениях медицинских организаций с высокими рисками возникновения и распространения клостридиальных инфекций. Основание - высокая эффективность (более 99,99% за 16 минут и 8 минут воздействия на расстоянии 4 и 2 метра от источника излучения соответственно).